Jun 04, 2023
Fc 코어 푸코실화 및 경쇄 이소형이 IgG1 유연성에 미치는 영향
Communications Biology 6권, 기사 번호: 237(2023) 이 기사 인용 847 3 Altmetric Metrics 세부 정보 액세스 N-글리코실화는 단클론 항체의 생체 활성을 조절하는 데 중요한 역할을 합니다.
커뮤니케이션 생물학 6권, 기사 번호: 237(2023) 이 기사 인용
847 액세스
3 알트메트릭
측정항목 세부정보
N-글리코실화는 단클론 항체(mAbs)의 생체 활성을 조절하는 데 중요한 역할을 하며, 경쇄(LC) 이소형은 물리화학적 특성에 영향을 줄 수 있습니다. 그러나 이러한 특징이 mAbs 구조적 행동에 미치는 영향을 조사하는 것은 이러한 생체 분자의 유연성이 매우 높기 때문에 큰 과제입니다. 이 연구에서 우리는 가속 분자 역학(aMD)을 통해 푸코실화 및 비푸코실화 형태 모두에서 κ 및 λ LC 항체를 대표하는 두 가지 상용 면역글로불린 G1(IgG1)의 구조적 거동을 조사합니다. 우리의 결과는 안정적인 형태의 식별을 통해 푸코실화와 LC 이소형의 조합이 어떻게 힌지 거동, Fc 형태 및 글리칸 사슬의 위치를 조절하는지, 모든 요인이 FcγR에 대한 결합에 잠재적으로 영향을 미치는지 보여줍니다. 이 작업은 또한 mAb의 형태적 탐색에 대한 기술적 향상을 나타내며 aMD를 실험 결과를 명확히 하는 데 적합한 접근 방식으로 만듭니다.
임상적으로 이용 가능한 대부분의 단클론 항체(mAb)는 면역글로불린 G1(IgG1)1입니다. 이는 다른 IgG 하위 클래스에 비해 더 높은 안정성과 강력한 효과기 기능 때문입니다. mAb는 3개의 도메인으로 구성됩니다. 두 개의 단편 항원 결합 도메인(Fab)과 하나의 결정성 단편(Fc)(중쇄 및 경쇄(각각 HC 및 LC) 포함), 둘 다 가변 영역과 불변 영역을 포함합니다. 가변 도메인은 적응성 면역 반응을 담당하거나, 상업용 mAb의 경우 표적 항원에 선택적으로 결합하는 역할을 합니다. 항체는 LC의 두 가지 다른 이소형, 즉 κ와 λ2를 나타낼 수 있습니다. κ 또는 λ LC를 포함하는 항체의 비율은 종에 따라 상당히 다르며3 약 100개의 승인된 치료용 mAb를 고려할 때 λ LC4를 포함하는 항체는 극소수에 불과합니다. Fab 도메인의 협동성과 유연성5, 상보성 결정 영역(CDR)6의 구조적 특성의 차이를 시사하는 이 두 가지 isotype 간의 기능적 및 구조적 비교에 대한 연구는 거의 발표되지 않았습니다. Fc와 특정 Fcγ 수용체(FcγR)의 상호작용에 의해 면역 체계를 활성화하는 IgG1의 능력은 Fc7,8에서 보존된 Asn297의 N-글리코실화에 의해 조절되는 주요 측면으로 간주됩니다. 글리칸의 길이, 구성 및 전하의 변화는 Fc 도메인의 구조적 무결성 및 형태에 영향을 미쳐 FcγR에 대한 결합 친화도를 변경하고 면역 반응에 영향을 미칠 수 있습니다9,10. 특히, 코어 푸코실화는 FcγRIIIa(저친화성 활성화 수용체)에 대한 IgG1의 결합 친화도를 감소시키기 때문에 항체 의존성 세포 세포독성(ADCC)에 영향을 미칠 수 있습니다1,11,12,13,14,15,16, 17.
이러한 관찰에도 불구하고 항원 인식 및 이펙터 기능 활성화 측면에서 이러한 생체 분자의 기능적 거동을 조절하는 데 있어서 LC 차이의 구조적 역할은 조사된 적이 없습니다. 일부 연구18,19에서는 이펙터 기능에 대한 푸코실화 효과를 설명하기 위한 가설을 제안했지만 힌지 및 Fab 도메인의 역할을 고려하지 않고 Fc에만 초점을 맞췄습니다. 이전 연구에서 우리는 푸코스의 존재가 전체 mAb의 구조적 행동을 조절하여 T자형 구조에 대한 선호를 유도할 수 있으며 원칙적으로 수용체 결합에 덜 적합하다고 제안했습니다. 이전 결과와 일치하여 Spiteri et al. 글리코실화된 IgG1과 비글리코실화된 IgG1을 비교하여 글리칸이 어떻게 구조적 제약을 도입할 수 있는지 입증했습니다. 이 연구는 글리칸 제거가 단백질의 유연성을 조절하고 항체가 다른 구조적 공간을 탐색하도록 하며 FcγRs21에 대한 결합에 영향을 줌으로써 Fab-Fc 분리에 영향을 미친다는 것을 보여줍니다. 이 연구에서 우리는 고전적 분자 역학 시뮬레이션과 가속 분자 역학 시뮬레이션(각각 cMD 및 aMD)의 조합을 기반으로 mAb에 대한 혁신적인 in silico 접근 방식을 사용하여 IgG1의 구조적 거동에서 푸코스와 두 LC 이소형의 역할을 조사합니다. ). κ 및 λ LC 항체의 우수한 모델인 2개의 상용 IgG1인 adalimumab 및 avelumab의 어푸코실화(G0) 및 푸코실화(G0F) 형태 간의 비교가 수행되었으며, 이는 IgG1. 우리가 아는 한, 표준 샘플링 MD 방법과 강화된 샘플링 MD 방법의 조합은 mAbs 구조적 행동의 맥락에서 사용된 적이 없습니다. 따라서 우리의 결과는 항체 유연성 조사에 있어 새로운 미래 관점(실험적 및 계산적)으로 나아갈 수 있는 길을 열어줄 수 있습니다.
90° for both Fab), as shown in Fig. 2. On the opposite, both G0 and G0F avelumab are prone to reach a T-shaped conformation, with θ > 90° in at least one Fab in G0 avelumab, and in both Fab domains in G0F avelumab. According to this analysis, the role of fucose in promoting the T-shaped conformation is confirmed for both isotypes. On the other hand, a putative role of the λ LC in promoting a T-shaped conformation, even in the absence of fucose, is figured out. Moreover, especially for avelumab, these results clearly spotlight the limit of cMD methods in exploring large conformational spaces of such flexible proteins. At the same time, aMD opens to the identification of other descriptors that allows a thorough investigation of the conformational behavior. Starting from these results, since the scope of aMD simulations was to identify minimum energy structures, the following analyses were focused on the frames and the corresponding conformations included in the identified energy minimum./p> 90° for both Fab domains, and we took into account also the conformational variability expected from MD simulations. The distance between the CH2 domains was measured between the glycosylated Asn using MDTraj38. Then, box plots were produced to evaluate the statistical significance of the observed values in the total 21,000 frames. For the aMD, a reweighing procedure was applied according to methods described by Miao et al.40 using Maclaurin expansion to the 10th order to approximate the free energy surface of the system as a function of θ angles. The RMSD matrices for the cluster analysis (of both cMD and aMD) were generated with CPPTRAJ41, while the clusters were obtained using a customized script based on the GROMOS algorithm42. In the case of antibodies C-alpha atoms were considered for the analysis, while for glycans the oxygens involved in glycosidic bonds. RMSD-threshold of 7.5 Å and 6.5 Å were used for the antibodies in cMD and aMD, respectively, and the maximum number of clusters was set to 15 and 10, respectively. For glycans clustering the RMSD-threshold was set to 1 Å and the maximum number of clusters to 10. The essential dynamics (ED) was computed on the overall trajectories by the covariance analysis tool of GROMACS 2020.120,43. Then, the resulting trajectories, projected along the first and the second eigenvectors, were filtered by the frames included in the energy minimum that was identified from the FES (computed as function of θ angles) and were used to calculate the Δϕ distribution. The minimum distance between glycan chains was computed by CPPTRAJ41 and the “nativecontacts” tool with the “mindist” option, while the distance between the center of mass of each chain and itself was computed with the “distance” tool. For the latter, the trajectories were pre-aligned on the Fc. The contacts between LCs and the hinge region were computed by CPPTRAJ41 with the “nativecontacts” tool, considering heavy atoms and a threshold distance of 4 Å. The hydrogen bonds (H-bonds) analysis was computed by a customized python script based on the MDTraj H-bonds identification tool20./p>3.0.CO;2-M" data-track-action="article reference" href="https://doi.org/10.1002%2F%28SICI%291521-3773%2819990115%2938%3A1%2F2%3C236%3A%3AAID-ANIE236%3E3.0.CO%3B2-M" aria-label="Article reference 42" data-doi="10.1002/(SICI)1521-3773(19990115)38:1/23.0.CO;2-M"Article CAS Google Scholar /p>
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